胃癌及癌旁组织定量比较蛋白质组学研究

罗治文1 谢笑娟1 马桂兰2 呼建文3 刘丽杰1 葛文松1 朱樑1**(1 第二军医大学附属长征医院消化科 上海 200003 2 解放军第513医院 兰州 732750 3 中科院上海生命科学院蛋白质组研究分析中心 上海 200031)摘要 为寻找胃癌特异的肿瘤标记物,用于胃癌

正文

罗治文1 谢笑娟1 马桂兰2 呼建文3 刘丽杰1 葛文松1 朱樑1**

(1 第二军医大学附属长征医院消化科 上海 200003 2 解放军第513医院 兰州 732750 3 中科院上海生命科学院蛋白质组研究分析中心 上海 200031)

摘要 为寻找胃癌特异的肿瘤标记物,用于胃癌临床诊断及药物治疗靶点的选择,本研究采用荧光差异显示凝胶电泳(DIGE)技术分离并筛选 Cy3、Cy5 及 Cy2 荧光素标记的胃癌及对应癌旁组织差异表达蛋白质,用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)或串联质谱技术进行鉴定并分析。结果共筛选出 33 个差异表达蛋白质点,其中 9 个蛋白质点在胃癌组织中上调,24 个蛋白质点下调。对 22 个蛋白质点采用质谱技术成功鉴定,突变结蛋白、锰超氧化物歧化酶、热休克蛋白 60等在胃癌中高表达,热休克蛋白 27、前列腺素 F 合酶、硒结合蛋白 1、锌指蛋白 160、微管蛋白 α6、真核生物翻译延伸因子 1 α1 等在胃癌组织中低表达,并筛选出 5 个未知蛋白。这些差异表达蛋白可望成为胃癌诊断的特异标记物,并与胃癌的发生、发展及预后等有关,为胃癌的诊断、发生机制的研究提供了新的思路。

关键词 胃癌 肿瘤标记物 DIGE 定量蛋白质组学

Quantitative and comparative proteomics analysis of gastric cancer and adjacent noncancerous tissues LUO Zhi-wen1 XIE Xiao-juan1 MA Gui-lan2 HU Jian-wen3 LIU Li-jie1 GE Wen-song1 ZHU Liang1

(1 Department of Gastroenterology, Chang-Zheng Hospital, the Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)

(2 The 513th Hospital of the PLA, Lanzhou 732750, China)

(3 Research Center for Proteome Analysis, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200031, China)

Abstract To identify specific protein markers for gastric cancer detection and diagnosis, as well as develop new potential therapeutic targets of the disease. Gastric cancer tissues and adjacent normal mucosa were examined by the fluorescence differential in-gel electrophoresis (DIGE) technique after labeled with CyDye DIGE fluors Cy3, Cy5 and Cy2. Protein spots detected differential with statistical significance were identified by MALDI-TOF MS or MS/MS. As the result, intensity changes of 33 spots were detected with statistical significance. 9 protein spots of them up-regulated otherwise 24 down-regulated in gastric cancer tissues. And 22 of them were identified by MALDI-TOF MS or MS/MS successfully. Several proteins up-regulated such as MnSOD, HSP60, mutant desmin et al. HSP27, prostaglandin F synthase, SeBP 1, zinc finger protein 160, tubulin alpha 6, eTEF1 A 1 and so on were down-regulated. Our results suggest that DIGE is a useful technique for differential expressed proteins screening and analysis in gastric cancer tissues which may be useful for the development of new molecular markers for diagnosis and prognosis of gastric carcinoma. This differently expressed proteins may be useful tumor markers for gastric cancer.

Key words Gastric cancer Tumor marker DIGE Quantitative proteomics

胃癌是常见的消化道恶性肿瘤,死亡率仅次于肺癌[1]。每年全世界有750 000 患者死于胃癌[2],我国每年有 16 万人死于胃癌[3],而胃癌高死亡率的主要原因是没有有效的早期筛选和诊断方法[4],因此,寻找早期诊断和筛选的有效方法对提高胃癌生存率非常重要。

近年来,蛋白质组学技术已经成为研究临床肿瘤疾病普查和早期诊断蛋白质标记物的有效工具,同时为研究肿瘤产生和发展的机制提供了技术平台[5~7]。有作者用双向凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)技术结合质谱技术筛选并鉴定了胃癌组织相关的一些蛋白质[8~9]。但普通 2-DE 技术存在敏感性、特异性、重复性较差,对疏水蛋白、小分子蛋白、膜蛋白分离有限等不足。荧光差异显示凝胶电泳(differential in-gel electrophoresis,DIGE)技术是由Amersham Biosciences公司发展起来的新的蛋白质组学技术,可以明显提高双向凝胶电泳的重复性和敏感性。DIGE 技术采用几种不同的荧光染料(Cy3、Cy5、Cy2)分别标记不同的蛋白质样品,并设立内标,可以在同一个双向凝胶上同时分离两种以上蛋白质样品,比较同一蛋白在不同组织中的丰度比[10,11]。

本研究中,采用 DIGE 技术筛选并鉴定了胃癌及其癌旁组织的差异表达蛋白质,寻找胃癌组织特异蛋白质标记物,以用于临床胃癌筛查和诊断,并为寻找胃癌治疗药物靶点、了解胃癌发生发展的分子机制提供思路。

1 材料与方法

1.1 标本采集及处理

3 例胃癌及癌旁组织均来自第二军医大学附属长征医院外科手术病人,经病理及免疫组化证实为 Ⅲb 期低分化腺癌。手术新鲜标本用生理盐水多次冲洗,并尽量切除结缔组织及坏死组织,癌旁组织为癌灶周围 5 cm 以外胃粘膜组织,均经病理证实无癌细胞侵润。所有标本用裂解液(7 mol/L urea,2 mol/L thiourea and 4% CHAPS(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethyl-ammonio]propanesulfonic acid))裂解后加入蛋白酶抑制剂(Cocktail),离心(4 ℃,14000 ×g,1.5 h)后取上清液用 Bradford 法(Bio-Rad)定量,所有样品 -70 ℃ 保存备用。

1.2 Cy- 染料标记及 2-DE

采用通用电气医疗集团(GE Healthcare,USA)提供的实验指南进行实验设计(表 1)。6 例各 50 μg 样品平均用 CyDye DIGE 染料 Cy3 和 Cy5 分别标记(400 pmol 染料∶50 μg 蛋白裂解液1 μL;pH 值 8.0 ~ 9.0 之间),内标用等量胃癌及癌旁组织(共 6 例样品)裂解液混合,并用 Cy2 标记。4 ℃ 下标记反应 30 分钟后用IPG(Immobilized pH gradients)胶条(Bio-Rad,pH 4-7,13 cm)进行第一向等电聚焦电泳(isoelectric focusing,IEF),溶胀液(DeStreak Reagent)由美国GE Healthcare 公司生产。然后用 Ettan DALT 系统进行第二向十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)。

1 不同荧光染料标记实验设计

Table 1 Experiment design of different fluorescent dye labeling

凝 胶

Cy2

Cy3

Cy5

1

内标

癌旁 1

胃癌 2

2

内标

胃癌 1

癌旁 3

3

内标

癌旁 2

胃癌 3

1.3 图像采集分析及质谱鉴定

用Typhoon 9410™ (GE Healthcare) 荧光扫描仪对凝胶进行扫描,并用 DeCyderTM v 6.5 软件(GE Healthcare,USA)进行分析。每一张胶扫描后得到 3 张扫描胶图(共 9 张胶图),对每一张胶图上的所有蛋白点扫描进行胶内分析(differential in-gel analysis,DIA)分析,然后对不同胶上的同一个蛋白点与内标匹配,进行胶间分析(biological vanation analysis, BVA),对匹配后的每个蛋白点的相对量比较(Cy3/Cy2 或 Cy5/Cy2)后确定差异蛋白,胃癌及癌旁组之间差异蛋白采用 t 检验进行定量比较(p < 0.05)。用 1 mg 样品重新进行双向凝胶电泳,建立制备胶,第二向凝胶电泳结束后进行胶体考马斯蓝染色,与 DIGE 胶图匹配后手动切胶切取相匹配的蛋白质点,对其用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)或串联质谱(tandem mass spectrometer,MS/MS)技术进行检测,获取 PMF(peptide mass fingerprint)指纹图谱,在NCBInr 20060526 蛋白质数据库中进行蛋白质匹配。蛋白质分值大于 64 为统计学显著有效(p < 0.05),串联质谱图分数大于 36 为显著有效(p < 0.05)。

2

2.1 双向凝胶电泳分离蛋白质

分别用不同波长激光对 Cy2(488 nm)、Cy3(532 nm)、Cy5(633 nm)进行扫描,得到不同颜色的扫描图(图 1 A 、B 、C),每张胶共得到大于 1800 个蛋白质点(胶 1:1898;胶 2:1824;胶 3:1813)(图 1 D)。与内标匹配分析后共获得 33 个差异表达蛋白质点(大于1.5 倍),其中 9 个点(304、313、490、866、902、919、1190、1213、1386)在胃癌组织中上调,24 个点(362、380、427、431、674、712、716、860、865、941、1115、1134、1146、1159、1250、1294、1434、1435、1449、1539、1583、1642、1673、1747)下调(图 2)。图 3 显示了部分上调和下调蛋白的曲线图和三维图。由于 DIGE 的上样量较小,而且染料有可能影响质谱检测结果,因此,用 1 mg 样品重新建立制备胶,和 DIGE 胶图匹配后共切到 27 个蛋白质点,对其进行后续质谱鉴定,其中866、1434、1449、1583、1672、1742未找到匹配点。

1 不同波长激光扫描双向凝胶图

A:Cy2 扫描图(黄色);B:Cy3 扫描图(蓝色);C:Cy5 扫描图(红色);D:凝胶上所有分离蛋白质标记图

Fig. 1 The scan results of one gel at appropriate wavelengths and the spot map

2 双向凝胶图及差异表达蛋白位点图

Fig. 2 A representative 2-DE map and the ID of the up- and down- regulated proteins

3 部分蛋白质点差异表达线图及三维图

A:点 941 为下调蛋白;B:点 1190 为上调蛋白

Fig. 3 Graph view and 3D simulation view of up- and down- regulated protein spots

2.2 MALDI-TOF MSMSMS)蛋白质鉴定结果

采用 MALDI 质谱技术共对 27 个差异蛋白进行了鉴定,其中有 5 个蛋白质点有 PMF 图,但在蛋白质库中未找到相匹配的蛋白质,其中点 902、1190 上调,362、712、941 下调。22 个点找到与 PMF 图匹配的蛋白质(表 2),共鉴定出 23 个蛋白质。部分蛋白肽质量指纹图谱及数据库匹配结果如图 4 所示。

2 胃癌差异蛋白点质谱鉴定结果

Table 2 Mass spectrometry identification of differential expressed protein spots

Spot No

Protein name

Regulation

Average ratio

Accession No

Obs.pI

Obs.Mr

Protein Sequence

304

chaperonin (HSP60)

up

2.14

gi|306890

5.70

61157

573 aa

313

mutant desmin

effector cell proteinase receptor 1 splice form 1b

up

2.06

gi|19908424 gi|2135059

5.21

9.27

53544

12659

470 aa

110 aa

380

selenium binding protein 1

down

-2.08

gi|16306550

5.93

52928

472 aa

427

fibrinogen gamma

down

-1.95

gi|223170

5.54

46823

410 aa

431

fibrinogen gamma

down

-2.88

gi|223170

5.54

46823

410 aa

490

hypothetical protein

up

1.55

gi|31873302

7.57

47405

434 aa

674

Human Muscle Fructose 1,6-Bisphosphate Aldolase Complexed With Fructose 1,6-Bisphosphate

down

-1.67

gi|4930291

39720

716

tubulin alpha 6

down

-1.76

gi|14389309

4.96

50548

449 aa

860

Eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1

down

-1.95

gi|48734966

9.10

50433

462 aa

865

zinc finger protein 160

down

-1.82

gi|38788302

9.44

96788

818 aa

919

unnamed protein product

up

5.03

gi|10435239

4.76

59383

533 aa

1115

Drug-Protein Interactions: Structure Of Sulfonamide Drug Complexed With Human Carbonic Anhydrase I

down

-2.09

gi|515109

28778

1134

Mitochondrial short-chain enoyl-coenzyme A hydratase 1, precursor

down

-3.08

gi|14286220

8.34

31835

290 aa

1146

prostaglandin F synthase

down

-3.88

gi|46389820

8.05

37220

323 aa

1159

heat shock protein 27

down

-1.74

gi|662841

7.83

22427

199 aa

1213

PREDICTED: similar to actin, alpha, cardiac; alphac-actin [Pan troglodytes]

up

1.65

gi|55641797

5.23

42334

377 aa

1250

Chain C, Crystal Structure Of Lipid-Free Human Apolipoprotein A-I

down

-1.64

gi|90108666

5.27

28061

243 aa

1294

biliverdin reductase B (flavin reductase (NADPH))

down

-1.81

gi|32891807

7.13

22219

206 aa

1386

Manganese superoxide dismutase

up

2.42

gi|34707

8.35

24866

222

1435

Chain A, Human Serum Albumin Mutant R218h Complexed With Thyroxine (3,3',5,5'-Tetraiodo-L-Thyronine) And Myristic Acid (Tetradecanoic Acid)

down

-10.97

gi|31615333

5.66

68406

585 aa

1539

Chain A, Crystal Structure Of The Ga Module Complexed With Human Serum Albumin Ga Module

down

-8.52

gi|55669910

5.57

67174

572 aa

1642

Chain F, Cypa Complexed With Hvgpia;

Chain H, Monoclinic Form Of Human Peroxiredoxin 5

down

-2.64

gi|2981764

gi|16975162

7.82

6.96

18098

17060

164 aa

161 aa

4 HSP27 肽质量指纹图谱(A)及数据库匹配图(B

Fig. 4 Peptide mass fingerprint (A) and probability based mowse score (B) of HSP27

3

荧光差异凝胶电泳(DIGE)是蛋白质组学研究的新技术[12,13]。用一种叫花青染料(cyanine dyes)的荧光素物质与蛋白质中的赖氨酸残基进行结合,把不同荧光素标记的样品在同一块双向凝胶上进行分离,用不同波长的激光激发后可以显示不同的颜色,因此,可以对两个以上样本中的微量蛋白进行相对定量研究。DIGE 技术的优点是:可以在同一凝胶上对不同样品中的蛋白质进行定量比较分析,并在每块凝胶中加入了内标,减少了普通双向凝胶电泳中不同凝胶间的误差,减少了实验重复次数;DIGE 可以对相对微量的蛋白质进行定量研究;DIGE 实验中一般用 Cy2 标记内标,用Cy3、Cy5 分别平均标记不同胶间的样品,独特的实验设计避免了染料量的不同影响实验结果。因此,DIGE技术具有较高的敏感性、特异性及较宽的动态范围等优点[12]。

在我们的实验中,采用了最小量标记法(1%~2% 的蛋白质被标记),因此,荧光素的量代表了某种蛋白的相对量,可以进行相对定量研究。每张质谱胶分离到 1 800 个左右的蛋白质点,具有较好的敏感性和重复性,其中 9 个蛋白质点在胃癌组织中上调,24 个蛋白质点下调。制备胶匹配后得到 27 个匹配点,并成功切胶后进行质谱分析。有 5 个蛋白质点(902、1190、362、712、941)在蛋白质库中未找到相应的蛋白质,可能为未知蛋白,有必要进一步深入研究。从 22 个蛋白质点中成功鉴定的 23 个蛋白质(表 2)中有 7 个蛋白上调,16 个蛋白质下调,表明胃癌发生和发展过程中蛋白质水平的改变比较复杂。

根据蛋白质功能的不同,这些差异表达的蛋白质可以分为 7 类:分子伴侣、细胞骨架蛋白、代谢酶类、细胞周期相关蛋白、细胞增殖、分化和凋亡相关蛋白和酯质代谢相关蛋白。热休克蛋白(HSP)是一种分子伴侣,可以调节细胞内多个信号通路中间物的活性,其中部分可能与细胞凋亡信号通路的调节有关,热休克蛋白可以分为促进凋亡和抑制凋亡两类[14]。一般认为,HSP 27 和 HSP 70 可以抑制细胞凋亡,而 HSP 60 和 HSP 10 促进细胞凋亡。因此,肿瘤发生后,HSP 60 可能升高而 HSP 27 水平可能降低。在我们的实验中发现,胃癌组织中 HSP 60 和 HSP 27 表达都有改变,HSP 60 上调而 HSP 27 下调,提示这两种热休克蛋白在胃癌发展过程中起到一定作用。Kamiya 等[15] 发现,HSP 60 在 Hp(Helicobacter pylori)感染的胃粘膜、胃癌细胞(MKN 45, KATO III 和 MKN 28)及胃癌活检组织中均可检测到,而目前认为,Hp 是胃癌发生的第一类危险因素,表明 HSP 60 可能与 Hp 感染和胃癌的发生、发展有关。HSP 27 与胃癌的关系目前还不是很清楚,Kapranos 等[16] 研究发现,HSP 27 在正常胃粘膜中的表达率为 79%,而在胃癌组织中的表达率为 62.7%,而且与肿瘤的淋巴结转移有关。提示HSP 27 下调可能与胃癌的转移有关。相反,Ryu 等[9] 报道 HSP 27 在胃癌组织中上调,提示 HSP 27 可能在不同的肿瘤发展阶段的表达水平不同,有必要进一步验证研究。

细胞骨架蛋白是亚细胞的丝状收缩骨架和结构蛋白,与维持细胞形态和细胞运动相关功能活性有关。本实验发现,微管蛋白 α6 在胃癌组织中下调,而突变结蛋白上调。微管蛋白是中心体蛋白,包括微管蛋白 α 和微管蛋白 β 两种,有作者报道在乳腺癌组织和癌前病变组织中上调[17,18]。Giarnieri 等[19] 认为微管蛋白可能与肿瘤的侵袭和转移有关。但目前尚无微管蛋白在胃癌组织中表达的报道。真核生物翻译延长因子 α 1(Eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1,eTEF 1 α 1)在蛋白质合成时中氨酰 tRNA 结合到核蛋白上的过程中意义重大。Tomlinson 等[20] 认为eTEF 1 A 2 可能是乳腺癌的癌基因蛋白,也是乳腺癌诊断的标记物和治疗的靶蛋白,作者也认为 eTEF 1 A 2 可能与蛋白合成、细胞骨架形成或凋亡有关。我们的研究结果表明,eTEF 1 α 1 蛋白在胃癌组织中的表达明显低于其癌旁组织,说明在癌组织中 eTEF 1 α 1 表达降低。提示 eTEF 1 α 1 蛋白表达下调可能与胃癌发生有关。推测 eTEF 1 的正常表达受抑制,可刺激细胞生长,促进细胞转移,导致细胞恶性转化,从而可能在翻译水平上诱发胃癌。

本实验中还发现许多代谢酶在胃癌组织中表达差异,包括:前列腺 F 合酶、果糖1、6-二磷酸醛缩酶(FBP-Ald)、碳酸酐酶 Ⅰ(CA Ⅰ)、锰超氧化物歧化酶(MnSOD)、线粒体短链烯酰辅酶 A 水解酶 1、胆红素还原酶 B、亲环素 A(CyP A)F 链、过氧化物酶 5 H 链等。前列腺素 F 合酶是由肾脏产生的类前列腺素物质,分为还氧化酶 1(cox-1)和环氧化酶-2(cox-2)。其中 cox-2 在消化道肿瘤中上调,与肿瘤的发生关系密切[21],在胃癌中的作用的研究也有许多文献报道。碳酸酐酶(CA)是一种含锌的金属合酶,可逆性催化 CO2 水合作用。CA Ⅰ 被认为与细胞增殖有关,快速增殖肿瘤细胞可以产生CA Ⅰ,因此,其有可能参与细胞增殖过程[22],也有作者发现CA Ⅰ 在胃癌中高表达[23]。锰超氧化物歧化酶是一个四聚体酶,含有四个亚单位,每个亚单位含有一个 Mn+3 原子。催化 2 分子超氧化物歧化为水和过氧化氢。有作者报道 MnSOD 可以抑制胃癌细胞 SGC 7901 的生长[24]。Czeczot 等[25] 也发现 MnSOD 在胃癌组织中上调。因此,MnSOD 有可能在胃癌发展过程中起作用,有待进一步研究。

在胃癌组织中也发现了一些与细胞周期、酯质代谢及细胞增殖、分化、凋亡有关的蛋白差异表达,如硒结合蛋白 1、锌指蛋白 160、载酯蛋白 A 1、纤维蛋白原 γ 等。He 等[26]也发现硒结合蛋白 1 在胃癌组织中下调。另外,本研究发现一个假设蛋白和一个未命名蛋白在胃癌组织中表达上调,提示它们可能与胃癌的发生、发展有关。

总之,我们利用 DIGE 技术初步筛选、鉴定并分析了多个胃癌组织相关差异表达蛋白质,这些上调或下调蛋白在胃癌的发生、发展过程中可能起到促进或抑制作用,有些蛋白可能是胃癌发生过程的特异产物,对这些蛋白,特别是未知蛋白、假设蛋白的深入研究,有可能发现有临床应用价值的胃癌标记物,为寻找胃癌治疗药物靶点,了解胃癌的发生、发展过程提供依据。同时,我们的研究也表明,DIGE 是蛋白质组学研究敏感性、特异性都较高的技术。由于胃癌组织标本中可能含有纤维组织、坏死组织等非胃癌细胞组织,因此,有必要对胃癌微切细胞等样品进一步研究,将更有利于了解胃癌差异表达蛋白质在胃癌发生、发展过程中的作用,寻找更特异的肿瘤标记物。

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