糖原累积病Ⅲ型AGL基因突变研究

以下论文发表于中华儿科杂志2009年6月糖原累积病Ⅲ型AGL基因突变研究王霞 邱文娟 叶军 韩连书 张惠文 蒋丽蓉 张雅芬 顾学范基金项目:上海市教委科研创新项目(09YZ99);上海交通大学校基金(2008XJ040);国家高技术发展计划(2007AA02Z447);十一五国家

正文

以下论文发表于中华儿科杂志2009年6月

糖原累积病Ⅲ型AGL基因突变研究

王霞 邱文娟 叶军 韩连书 张惠文 蒋丽蓉 张雅芬 顾学范


基金项目:上海市教委科研创新项目(09YZ99);上海交通大学校基金(2008XJ040);国家高技术发展计划(2007AA02Z447);十一五国家科技支撑计划课题(2006BAI05A05, 2006BAI05A07);上海市卫生局联合攻关重大研究项目(2008ZD001)

通信作者:邱文娟(Email:wenjuan_qiu@yahoo.com.cn)

【摘要】 目的 研究糖原累积病Ⅲ型(glycogen storage diseases type Ⅲ,GSD Ⅲ)患者糖原脱支酶AGL基因突变情况。 方法 采用PCR、DNA直接测序法,对临床表现为肝大、低血糖、生长落后、运动耐力下降的10例GSDⅢ患者的糖原脱支酶基因进行突变检测。检出突变的片段再经DNA双向测序证实。采用限制性内切酶片段长度多态性和荧光PCR结合基因扫描方法证实5个新突变。结果 10例患者中共检出13种突变类型,包括4种剪切突变:IVS6+1G>A、IVS6-1G>A、IVS14+1G>T、IVS26-2A>C;5种无义突变:R469X、R864X、S929X、R977X、Y1428X;3种缺失突变:c.408-411delTTTG、c.2717-2721delAGATC、c.2823delT;1种插入突变:c.4234insT。除IVS14+1G>T、R864X和R977X,其余10种均未见报道过。限制性内切酶片段长度多态性分析证实了3个新剪切突变,荧光PCR结合基因扫描方法证实2个缺失突变的缺失碱基数。2例患者仅检出1个致病突变,其余患者均明确有2个致病突变,突变检出率为90%。IVS14+1G>T突变频率最高,占25%。 结论 10例GSDⅢ型患者的糖原脱支酶基因突变呈高度异质性,发现13种突变,其中10种是新突变,IVS14+1G>T是最常见的突变类型。

【关键词】 糖原贮积病Ⅲ型; 糖原脱支酶系统;突变

糖原累积病Ⅲ型(glycogen storage diseases type Ⅲ,GSDⅢ, MIM # 232 400)是一种常染色体隐性遗传的糖代谢障碍疾病,由于糖原脱支酶(glycogen debranching enzyme,AGL)基因先天性缺陷所致。该酶在糖原分解中发挥α-1,4葡萄糖基转移酶(EC 2.4.1.25)和淀粉1,6-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.33)的作用。患者AGL基因先天性缺陷,糖原支链不能完全被分解,导致带短支链的异常糖原(极限糊精)堆积在肝脏、肌肉和心肌中,临床表现为肝大、空腹低血糖、生长落后、运动耐力下降[1]。AGL基因定位于染色体1p21,长约85 kb,包括35个外显子,其转录起始点为第3外显子的第69个碱基。已报道的AGL基因突变至少达70种,主要来自西方国家,为了解我国患者的基因突变情况,2007年10月-2008年7月,我们对10例GSDⅢ患者进行了基因突变检测。

对象和方法

一、对象

10例患者中9例来自本院,1例来自上海儿童医学中心。9例平均年龄7.2岁(3~14岁),1例是从6岁开始即在我院随诊的患者,现年龄25岁。患者起病年龄为1.5岁(0.5~2岁),主要症状是肝大, 矮小。实验室检查有低血糖,AST和ALT升高,高血脂,肌酸激酶(CK)升高。各项检查结果以中位数(范围)表示,空腹低血糖2.0 mmol/L(0.84~2.99 mmol/L),AST 453 U/L(139~798 U/L),ALT 349 U/L(98~612 U/L),γ-谷胱甘肽转移酶159 U/L (27~327 U/L),血清总胆固醇5.0 mmol/L(3.6~6.02 mmol/L),甘油三酯 2.9 mmol/L(2.05~5.13 mmol/L),CK 1785 U/L(380~4290 U/L),血乳酸1.27 mmol/L(0.7~2.6 mmol/L),血尿酸356.5 mmol/L(231~455 mmol/L)。肝糖原累积病以GSDⅠ型和GSDⅢ型最常见,口服葡萄糖实验可做鉴别诊断[2,3],GSDⅠ型患者常表现为空腹血乳酸增高(>3.0mmol/L)和口服葡萄糖后血乳酸呈明显下降。而本组10例患儿空腹血乳酸水平正常或稍高于正常参考值(的正常人。

二、实验方法

1.基因组DNA抽取:抽取并分离患者及其父母、对照组外周血白细胞,采用苯酚-氯仿法提取基因组DNA,-20℃保存。

2. AGL基因突变分析:根据AGL基因序列(Genebank Accession No:NM_000642),设计30对引物,扩增包括AGL基因编码区的33个外显子及两端内含子序列。按下列条件进行PCR反应:基因组DNA 200 ng、dNTPs 200 μmol/L、引物0.5 μmo/L 、10×Taq DNA聚合酶缓冲液、Taq DNA聚合酶5 U、加水至终体积50 μl。外显子8、12、16、24、28的PCR扩增程序为:95 ℃预变性5 min,94 ℃变性40 s、44~47 ℃退火35 s、72℃延伸35 s,循环31~35圈,72 ℃再延伸7 min。其余外显子的PCR扩增程序:除退火温度提高到52~58℃范围内外,其余与上述程序相同。PCR产物经纯化后,采用ABI Big Dye Terminator 测序试剂盒在ABI377测序仪上进行测序(上海基康生物技术有限公司)。突变外显子片段均进行DNA双向测序证实,并且对患者父母行相应外显子DNA测序,分析突变来源。

3.限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)分析:对测序所发现的3个新剪切突变(IVS6+1G>A、IVS6-1G>A、IVS26-2A>C),在患者家系和对照组中行RFLP分析验证。外显子6野生型504 bp片段可被BsrⅠ酶切成353 bp和151 bp片段,IVS6+1G>A突变使该酶切位点消失,突变片段不可被消化。外显子7野生型551 bp片段可被AluⅠ酶切成363 bp和188 bp片段,IVS6-1G>A突变使该酶切位点消失,突变片段不可被消化。外显子27野生型180 bp片段可被Hpy188 I酶切成97 bp和83 bp片段,IVS26-2A>C突变在108 bp处增加了一酶切位点,97 bp片段又被消化成72 bp和25 bp小片段。酶切产物均经电泳后拍照。

4.荧光PCR结合基因扫描分析:对DNA测序发现的2个缺失突变(c.408-411delTTTG、c.2717-2721delAGATC)采用荧光PCR结合基因扫描技术验证缺失的碱基数。

针对c.408-411delTTTG突变设计引物:

Fam-5F:5\" -CTACCCTTGGACTGTGTTACTCTTCA-3\" ;

5R:5\" -AAAGCAAGCTGACATTACCTGATTC-3\" ;

针对c.2717-2721delAGATC突变设计引物:

Fam-22F :5\" -TCCAATTCTTAGTCTTGCCTCCA-3\" ;

-22R :5\" -CATAGCACCCTCCACCATCTTC-3\" ;

上游引物均用Fam荧光标记。采用多通道PCR仪(PTC-220,美国)扩增后,将PCR产物1μl和甲酰胺3μl、Gene ScanTM500 ROXTM内标1μl混匀变性后,在DNA全自动测序仪(ABI Prism 3100,美国)上进行毛细管电泳,利用Data Colletion 3.0软件收集数据,采用基因扫描软件(GeneScan Analysis3.7)明确扩增各片段长度。

结 果

一、 AGL基因突变情况

10例共检出13种突变类型,包括4种剪切突变:IVS6+1G>A、IVS6-1G>A、IVS14+1G>T、IVS26-2A>C;5种无义突变:R469X、R864X、S929X、R977X、Y1428X;3种缺失突变:c.408-411delTTTG、c.2717-2721delAGATC、c.2823delT;1种插入突变c.4234insT。除IVS14+1G>T、864X、R977X,其余10种均为新突变。2例仅检出1个致病突变,其余患者均明确2个致病突变,总突变检出率为90%。IVS14+1G>T突变率最高,占25%,其次是IVS26-2A>C突变,占10%,其余突变类型各占5%(表1、图1-3)。

二 、 RFLP分析结果

对测序所发现的3个新剪切突变IVS6+1G>A、IVS6-1G>A和IVS26-2A>C分别采用BsrⅠ,AluⅠ和Hpy188 I行RFLP分析如下,50名正常人对照组RFLP分析均未发现携带3个新剪切突变的等位基因(图2):

(1) BsrⅠRFLP分析显示,IVS6+1G>A突变患者携带IVS6+1G>A杂合突变,来源于其父亲,酶切后呈504/353/151 bp带型。

(2) AluⅠRFLP分析显示,IVS6-1G>A突变患者携带IVS6-1G>A杂合突变,来源于其母亲,酶切后呈551/363/188 bp带型。

(3) Hpy188 IRFLP分析显示,IVS26-2A>C突变患者是IVS26-2A>C的纯合突变,酶切后呈83/72/25 bp带型。其父母是该突变的杂合子,酶切后呈97/83/72/25 bp带型。

三、荧光PCR结合基因扫描结果

经测序发现1例患者携带这2个缺失突变:c.408-411delTTTG和c.2717-2721delAGATC,对2个缺失突变行荧光PCR结合基因扫描分析发现, c.408-411delTTTG来源于母亲,PCR扩增片段呈109/113 bp双峰。c.2717-2721delAGATC来源于父亲,PCR扩增片段呈93/98 bp双峰(图3)。

讨 论

随着1992年AGL基因结构的明确和对患者基因突变的检测,GSDⅢ型的AGL基因突变谱基本得以明确。AGL基因位于1p21,是长约85kb的大单拷贝基因,包括35个外显子。根据不同剪切起始点,AGL基因至少可形成6种剪切异构体,异构体1在各种组织中表达最广泛,其转录起始点为第3外显子的第69个碱基,转录后编码成1532个氨基酸约175 000可溶性蛋白[1,5]。研究发现,AGL突变有显著的异质性,不同种族不同地理来源的人群有不同的突变类型。AGL基因突变的研究主要来自国外,法罗群岛GSDⅢ发病率高达1:3500,热点突变是R408X[6];北非犹太人的发病率为1:5400,4455delT是其特有突变类型[7];高加索人的发病率1:100 000,常见突变有R864X(10.3%)、c.3964delT(6.7%)、IVS32-12A>G(5.5%)、R1228X(5.2%)[8]。中国人中曾有8例GSDⅢ型报道:Lam等[9]报道过2例2715-2719del4和R408X突变纯合子,庄太凤等[10]报道了6例,但其突变检出率仅为41.7%,1例携带2341-2349del8纯合突变,3例仅分别携带E450X, 4664insCT和Y429X杂合突变,2例未发现致病突变。本组10例共检出13种突变,10种是新突变,提示了中国患者AGL基因突变也呈高度异质性。IVS14+1G>T突变在本组患者中的突变频率最高,占25%。日本曾报道过的17例GSDⅢ中有3例为该突变杂合子[11],提示此突变可能是亚洲地区GSDⅢ型相对常见的突变。本组有2例仅发现1个致病突变,推测其另一个突变可能在内含子、3\" 或者5\" 端非翻译区、转录启动子等区域。

AGL酶蛋白有3个重要的结构功能域,糖原结合区位于羧基外显子31-34区域内,它不仅能结合底物,也是稳定酶蛋白构象的重要结构;α-1,4-葡萄糖转移酶活性功能域由外显子6和外显子13~15的Asp535、Glu564、Asp670位点构成;淀粉1,6-葡萄糖苷酶的活性与外显子26、27的Asp1089、Asp1147位点密切相关[8]。4种剪切突变中IVS14+1G>T是已报道突变,Okubo等[12]通过对AGL mRNA研究,发现该剪切突变导致AGL mRNA短缩124 bp,翻译后65%肽段缺失,酶蛋白活性下降。3个新剪切突变(IVS6+1G>A、IVS6-1G>A、IVS26-2A>C)各位于外显子6、7和26的剪切供/受体位置上,这3个外显子均参与AGL酶蛋白两个催化亚单位的形成,其附近的剪切突变可能使相应外显子被跳过而不被翻译,也可能激活隐蔽剪切位点导致部分内含子序列插入,影响功能结构域的正常形成,最终导致活性下降。正常对照组RFLP分析基本排除了这些新突变为多态性的可能性,但各突变对AGL基mRNA转录以及蛋白活性的影响尚待进一步研究。

多数无义突变导致mRNA短缩,并很快为RNA监视机制降解而成为无效的等位基因-即NMD效应(nonsense-mediated mRNA decay)[13]。本研究所发现的5种无义突变可能通过上述机制影响酶的活性。可造成读码框移位的缺失和插入突变的致病机制也是NMD效应,3种缺失突变c.408-411delTTTG、c.2717-2721delAGATC和c.2823delT突变分别缺失了4、5和1个碱基,导致读码框移位,并分别在下游第157、911 和960密码子处提前出现终止密码;c.4234insT插入突变也可导致读码框移位,并在下游28bp处提前出现了终止密码子。

AGL基因突变检测和AGL酶活性测定均为GSDⅢ型确诊方法。因AGL在肌肉、肝脏、外周血白细胞中均有表达,但白细胞中表达量很少,故国外常采用肌肉或肝脏活检测定AGL活性明确诊断。但因其为有创检测,患儿及家属难以接受。Maire等对127例肝糖原累积病中的32例通过AGL酶活性测定确诊为GSDⅢ患者的生化指标回顾性分析发现:GSDⅢ患者血乳酸均和心肌肥厚等并发症[3,8,14],本研究中1例25岁成年患者已出现肌力下降。

本研究对10例临床初诊为GSDⅢ患者进行基因检测,总突变检出率达90%,发现了13种突变类型,包括5种无义突变、4种剪切突变、3种缺失突变、1种插入突变,10种是未报道的新突变,提示中国人中AGL基因突变具有高度异质性。IVS14+1G>T突变频率较高,可能是中国人中一种较常见的突变类型。AGL的基因诊断将为该组患者的治疗、预后评估、家系产前诊断等提供重要依据。

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(收稿日期:2008-08-22)

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