1 6份缓症链球菌中毒性休克综合征患者血清中外毒素蛋白的测定

卢洪洲 翁心华 尹有宽 朱 白 彭宝珍△△ 龚祖埙△△(复旦大学附属华山医院传染病科上海200040; 江苏省海安县人民医院传染病科海安226600中国科学院上海生物化学研究所上海200032)【摘要】 目的检测缓症链球菌中毒性体克综合征患者血清中可能存在的缓症链球菌外毒索,探讨

正文

卢洪洲 翁心华 尹有宽 朱 白 彭宝珍△△ 龚祖埙△△
(复旦大学附属华山医院传染病科上海200040; 江苏省海安县人民医院传染病科海安226600
中国科学院上海生物化学研究所上海200032)
【摘要】 目的检测缓症链球菌中毒性体克综合征患者血清中可能存在的缓症链球菌外毒索,探讨其与临床表现之间的关系。方法采用ELISA竞争法,用亲和法纯化的兔抗缓症链球菌外毒索抗体测定患者血清中含有的缓症链球菌外毒素。结果经过纯化的兔抗缓症链球菌外毒素抗体IgG与正常人血清反应后,经酶标仪读数OD均值为0.412(±0.001),与16份患者的血清反应后读数均小于0.412的I临界值。结论缓症链球菌中毒性休克综合征患者血清中含有缓症链球菌外毒索。
【关键词】缓症链球菌; 中毒性休克综合征; 外毒素
【中国图书馆分类法分类号】R 515.9
Assay on Exotoxin in the Serums of 16 Patients with Streptococcus M itis Toxic Shock Syndrom e
LU Hong—zhou,WENG Xin—hua,YIN You—kuan,ZHU Bai ,PENG Bao-zhen ,GONG Zu—xun
(Department ofInfectious Diseases,Huashan Hospital,Fudan University,Shanghai 200040;
Hal’a CountyHospital,Hai’a ,Jiangshu 226600;Shanghai Biochemistry Institute,ChineseAcademy ofSciences,Shanghai 200032,Ch ina)
【Abstract】Purpose To explore the tx~ible Streptococcus mitis exotoxin in the serums of patients with
S.mitis toxic shock syndrome and to investigate its relation with clinical manifestation. Methods Puri—
fied rabbit antibodies IgO to the S.mitis exotoxin was achieved by affinity column and then enzyme linked
immtmc~ rbent competitive assay Was applied to detect the bacterial toxin in the serum of the patients. Re—
stilts The mead 0D value is 0.412(±0.001)after seFLir~neutralization test between health people and
the purificatus rabbit IgG against S.mitis exotoxin.Every OD value is less than 0.4 12 cut off value after
serum neutralization test between each of the 16 patients an d the purificatus rabbit IgG anainst S.mitis exo—
toxin. Conclusions There exist S.mitis exotoxin in the serums of the patients with S.mitis toxic shock
syndrome.
【Key words】streptococcus mitis; toxic shock syndrome; exotoxin
自20世纪80年代中期以来,由链球菌引起的感染明显增加,其严重的临床表现为链球菌中毒性休克综合征(streptococcus toxic shock syndrome,STSS)。国外报道的STSS均为由8一溶血的化脓性链球菌引起,可造成多器官功能损害,病死率达30% 。对其发病机制的研究表明链球菌致热性外毒素(streptococcal pyrogenie exotoxin,SPE)可作为超抗原(superantigen,SAg)引起一系列病理改变,包括:致热性、增强宿主对致死性内毒素休克、其他因子对心肌损害的敏感性;对血脑屏障和血管通透性的影响和促进脾脏有丝分裂增加. 。既往认为a一溶血链球菌均不产生SPE,但1990年冬至1991年春,江苏海安、无锡、如东等长江三角洲地区发生数千例猩红热样疾病流行,20%表现为STSS,经积极治疗多数很快康复,鲜见死亡。此后每年这个季节均有散发L2 J。流行期间江苏省海安县人民医院采集到40份患者咽拭培养,从32份标本中分离鉴定出占优势的草绿色链球菌,血液培养均为阴性。经对病原体进行鉴定、生化试验、动物试验及血清学调查,并结合临床症状和流行病学分析,确定致病菌为a溶血的缓症链球菌。我们对缓症链球菌获取的致热性外毒素蛋白进行了毒理研究 J。纯化的毒素蛋白相对分子质量为34 000,等电点为6.2(偏酸性),氨基酸组成和末端序列均不同于0一溶血性链球菌外毒素,说明此外毒素可能是一种新的链球菌外毒素【 。本研究的目的是用ELISA竞争法检测1995年收集的流行区16份患者血清中是否含有毒素蛋白,以证明其临床表现与毒素蛋白的关系。
材料和方法
纯化的外毒素免疫家兔——抗血清的制备动物:新西兰大耳兔2.5 kg,雄性,3只。主要试剂及材料:福氏完全佐剂(complete freunds adjunvant,CFA:石蜡油、羊毛脂、卡介苗);福氏不完全佐剂(IFA:石蜡油、羊毛脂);三通阀;3 mL注射器;19一G、21一G、22一G 的针头。DEAE一纤维素DE一52层析柱及主要试剂均为美国Sigma公司出口。缓症链球菌外毒素蛋白在API 20培养基中振荡培养、离心后,上清液用(NH4)2SO4分段盐析,经透析、阴离子交换、快速蛋白液相色谱系统(FPLC)和polymixin B吸附色谱法得到最终纯化的蛋白。免疫动物前采血,用10 mL离心管收集血液,制备抗血清阴性对照;将纯化的外毒素抗原1 mg溶于1.5 mL 0.017 5 tool/L PBS(pH 7.4)中,与佐剂混合后免疫动物。多点法免疫动物:第一、二次间隔1个月,第三、四次间隔15 d;耳静脉注射:第5至第7次分别间隔3 d,最后一次追加免疫后第6天动脉放血。血液置无菌离心管室温4 h以形成血凝块,然后置4℃ 冰箱过夜,使血凝块收缩。将血清移人一个新的离心管中,4℃ 离心6 000 r/min,30 min,收集血清。抗体IgC的分离、纯化按参考文献[5]进行。上样为5 mL时可得IgC 35 mg。经免疫双扩散证明效价达1:64。分装抗血清,一20℃ 保存。正常兔抗血清制备方法同上。亲和层析法纯化兔抗体IgG 0.1 mmol/L乙酸缓冲液、偶联缓冲液及封闭液的配制按参考资料进行【6,7J。正常人血清与正常兔抗体IgG的活化实验步骤按参考文献[7]进行。将由34 000毒素蛋白免疫产生的兔抗体IgG 经过上述正常人血清和正常兔抗体IgG—Sepharose 4B亲和层析柱,吸附去除非特异性的反应物,以避免下一步实验中的交叉反应。酶标竞争法测定患者血清中的外毒毒蛋白 仪器:酶标读数仪为日产BIO—RAD 550型微板读数仪;羊抗兔IgG-HRP,上海西巴斯公司生产;96孔酶标板,浙江玉环医用仪器厂。16分患者血清为现场采集的TSS住院患者标本,经一20℃保存。100份正常人血清为上海某研究所健康人员体检标本。包被液试剂、洗涤缓冲液、封闭液、终止液和显色液的配制按参考文献[8]进行。抗原的包被:将纯化的34 000毒素蛋白(10g/mL);tjI1.K.96孔酶标板,每孔50 L,置4℃过夜,洗涤3次,每次3~5min,用封闭液在37℃ 封闭1 h,洗涤3次,每次3~5 rain。实验步骤参考相关资料进行[9]。竞争反应设以下3组:实验组:将经过吸附纯化的兔抗毒素抗体IgG,根据不同倍比浓度的稀释抗体与底物反应的显色程度确定稀释抗体浓度为5 000倍,取16份患者的血清100 L与等量的兔抗毒素抗体IgG稀释液摇匀混合,37℃反应1 h,加入上述抗原包被好的酶标板中,每孔50 L,37℃反应1 h。对照I组:采用正常人血清84份按上述同样方法与等量的兔抗毒素抗体IgG稀释抗体反应,37℃ 反应1 h。在酶标仪上读数算出平均值作为临界值(cut off值)。对照Ⅱ组:正常人血清16份,不加兔抗毒素抗体IgG稀释抗体而加蒸馏水,经37℃ 反应1 h。用洗涤缓冲液洗涤3次,每次3~5 min,在酶标仪上读数算出平均值。另取抗原包被板16孔作空白对照。根据不同倍比稀释度的羊抗兔IgG—HRP在反应中的显色程度,确定各孔中加入羊抗兔IgG-HRP的稀释度为1:2 000,经37℃反应30 min。用洗涤缓冲液洗涤3次,每次3~5min,然后分别加入50 L显色液,37℃反应20 min后终止。
结果
酶标竞争法测试结果 1:5 000兔抗缓症链球菌IgG抗体稀释液与包被的抗原能充分结合,读数最高均值为0.414(±0.002);1:5 000抗体稀释液加正常人血清,因不含有外毒素,不消耗抗体,均值读数也应为0.414,但实际上由于正常人血清的掩盖效应,会使得读数稍低于理论值,本实验中为0.412(±0.001),若标本中含有外毒素就会消耗抗体,使得读数下降,故应采用0.412为临界值。实验中的对照组因不存在抗原与抗体的结合反应,故读数应接近0,本实验中均值分别为0.005(±0.001)和0.004(±0.001),均接近0。实验组与对照组在酶标仪上(450 nm)读数平均值:1:5 000抗体稀释液:0.414(±0.002);1:5 000抗体稀释液加正常人血清:0.412(±0.001);正常人血清:0.005(±0.001);空白对照:0.004(±0.001)。采用1:5 000抗体稀释液与16份患者血清进行酶标竞争反应后,经酶标仪读数结果皆<0.412(表1),说明患者血清中含有此种缓症链球菌外毒素。在病程5 d内的血清读数最低,说明含有外毒素最多,而随着病程延长,读数有增加的趋势,如病程14 d为0.397,说明血清中外毒素含量下降。
表1 16份患者血清外毒素检测结果
Tab 1 Exotoxin assay results in the Senmls of 16 patient

Chronology(days) OD values Chronology(days) OD values
2 0.047 6 0.056
3 0.012 7 0.267
4 0.016 8 0.047
4 0.094 9 0.127
5 0.048 10 0.129
5 0.071 11 0.137
5 0.097 12 0.185
5 0 115 14 0.397
讨论
我们采用已知抗体测定抗原的方法,用ELISA竞争法检测现场患者血清中含有的外毒素。利用纯化的毒素免疫新西兰兔,测定产生的抗体(IgG)效价为1:64。含抗体的血清经饱和的硫酸铵盐析,再经DEAE纤维素柱层析、洗脱,即得粗提的IgG。将此IgG 用正常人IgG—Sephrose 4B和正常兔IgG—Sephrose 4B先后吸附,从而避免了非特异性的交叉反应所造成的误差。取现场收集的患者血清16份,以100份正常健康人血清为对照,把纯化的毒素包被在酶标板上,用酶标ELISA竞争法在酶标仪上(450 nm)读数,测得1:5 000抗体稀释液为0.414(±0.002);1:5 000抗体稀释液加正常人血清为0.412(±0.001);疫区16份患者血清读数皆<0.412,说明患者血清中含有此种缓症链球菌外毒素,而正常人不含有此种缓症链球菌外毒素。我们1995年从疾病暴发区收集的血清标本,经一20℃保存至今,仍可测得其含有的毒素,说明本方法具有很高的实际应用价值。在f}_溶血性链球菌感染的诊断方面,抗“O”测定的特异性较差,我们推测能否对8-溶血性链球菌也采用此种测定抗原的方法,以提高临床诊断的阳性率【lUJ。一般的B一溶血性链球菌感染是否也有外毒素的参与,在致病机制中也发挥重要的作用,是否也可采用此种方法进行测定。但由于本实验中收集的标本数仅有16份,检测结果可能有其局限性,至于患者体内毒素的定量(即标准曲线的测定)及病程在多长时间后血清中才测不到毒素等问题有待进一步研究。
参考文献
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(收稿日期:2002—08—19)(编辑:刘忠英)

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