电针治疗大脑中动脉梗塞模型大鼠胆碱乙酰转移酶表达变化

[摘要]:目的 观察电针治疗后大脑中动脉梗塞模型(middle cerebral artery occlusio -n,MCAO)大鼠胆碱乙酰转移酶(choline acetyl transferse,CHAT)表达变化,为探讨针刺改善学习记忆能力提供理论依据。方法 将大鼠随机分

正文

[摘要]:目的 观察电针治疗后大脑中动脉梗塞模型(middle cerebral artery occlusio -n,MCAO)大鼠胆碱乙酰转移酶(choline acetyl transferse,CHAT)表达变化,为探讨针刺改善学习记忆能力提供理论依据。方法 将大鼠随机分为对照组(正常大鼠)、实验组(局灶性脑缺血的大鼠)、治疗组(局灶性脑缺血的大鼠+针刺),采用荧光定量逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription polymerse chain reation, RT- PCR)技术观察各组大鼠CHAT的动态变化。 结果  治疗组大鼠TH、ChAT活性比实验组有显著提高( P<0.01 ) ,并已接近对照组的正常大鼠。结论 大脑中动脉梗 塞模型大鼠经针刺治疗后胆碱乙酰转移酶的阳性表达可能是学习记忆障碍的神经生物学基础之一。

[关键词]:针刺;;大脑中动脉;梗塞; 胆碱乙酰转移酶;RT- PCR

Change of Electroacupuncture on Expression of Choline Acetyl Transferase after Ischemia in Brain of Rats with Middle Cerebral Artery-Occlusion

TIAN Ming-Xiu1 ,YANG Xiu-Feng2,PAMG Jin-Kui3,YANG Xin-Yu4,CHEN Jia-Jun5

(1. Dapartmeng of Neurology,The First Hospital of Jinlin University,Jilin Changchun 130021,China; Tianjin-people's-hospital Tianjin 300130 ,China;

2.Daqing Oil Field General Hospital Group,Heilongjiang Daqing163000,Chia;

3. Dapartmeng of Endocrine,The Fourth Hospital of Daqing,Heilong-jiang Daqing 163712,China;

4. Dapartmeng of Surgery,T,he Second Hospital of Jilin University,Jilin Changchun 130041,China;

5 Dapartmeng of Neurology,China-Japan Union Hospital ,Jinlin University,Changchun 130021,China.)

Abstract】 Objective To study the changes and roles of choline acetyl transferase in brain of rats after cerebral ischemic injury. Methods Wistar rats were randomly divided into three groups:normal group,sham group and model group(electroacupunct

-ure group).The technique of reverse transcription polymerase chain reaction is used to observe the dynamic changes of choline acetyl transferse. Result Electroacupunc -ture could increase the choline acetyl trasferase positive remark in the brain of rats with middle cerebral artery occlusion. Conclusion Electroacupuncture could increase expression of choline acetyl transferase .the increased expression of choline acetyl transferase may be one of the neurobiological base of the learning and memory impairment of rats with middle cerebral artery occlusion.

Key words】electroacupuncture ;middle cerebral artery; Cerebral ischemia ;  choline acetyl transferase; RT- PCR

0 引言

中枢胆碱能系统在学习记忆行为中有重要的调节作用。有报道[1] 学习记忆障碍动物脑中与学习记忆过程相关的神经递质(如乙酰胆碱)及其酶的含量与代谢存在变化。而胆碱能神经功能紊乱被认为是学习记忆障碍的主要原因,胆碱乙酰转移酶(choline acetyl transferase,CHAT)是与学习记忆最相关的神经递质乙酰胆碱的代谢合成酶,胆碱乙酰转移酶在记忆相关脑区的含量高低与学习记忆能力成正相关。本实验通过系统观察电针治疗前后大脑中动脉梗塞模型[15](middle cerebral artery occlusio -n,MCAO)大鼠的胆碱乙酰转移酶(choline acetyl transferse,CHAT)表达的改变,探讨学习记忆障碍的神经生物学基础。

1  材料与方法

1.1  模型制备与分组

实验用纯系Wistar大鼠,雌雄不分,体重200~300g,全部实验用大鼠均由长春市高新技术开发区动物繁殖中心提供。实验动物以10%的水合氯醛(0.32ml/100g)腹腔麻醉后,仰卧固定于手术台上。颈部正中切开皮肤及浅筋膜,钝性分离胸锁乳突肌与胸骨舌骨肌,暴露颈总动脉(CCA)与迷走神经,在颈总动脉近心端结扎,结扎颈外动脉(ECA)主干,用双极电凝器电凝联系颈外动脉与颈内动脉之间的动脉分支,在颈内动脉穿线备用,在颈总动脉结扎的上端距离颈总动脉分叉处剪一小口,用制备好的鱼线沿颈总动脉插入颈内动脉,当到达指定长度(18.50±0.50mm左右)时结扎颈内动脉。线栓尾端留0.20mm于ECA切口处,最后消毒、缝合皮肤。此法[7]造成左侧大脑中动脉供血区永久性局灶性缺血。术后随机分组,每24只为一组,分为实验组(局灶性脑缺血的大鼠)、治疗组(局灶性脑缺血的大鼠+针刺)。以上两组与对照组(正常大鼠)各分成四个时间点,分别为6h、24h、3d、7d。提取各组各时间段的大鼠脑组织。

1.2电针方法

治疗组动物清醒后立即给予针刺,其中,双侧内关穴及双侧足三里穴加电针,强度以大鼠肢体颤动为度,百会穴施以平补平泻法,以医生手下感到沉紧为度。

1.3仪器及试剂

主要实验仪器:超速低温离心机:Germany Heraeus;紫外分光光度仪:上海第三分析仪器厂;PCR仪:America BIO-RAD company;水平电泳仪:北京六一仪器厂;紫外透射反射检测分析仪:上海复生生物工程研究所;数码照相机:SEAGULL DF-2。主要实验试剂 :RNA提取试剂盒:(Promega产品);逆转录试剂盒:(MBI产品);Tag pluIDNA聚合酶:(Sangon产品);DNA-Marker;琼脂糖;DEPC;饱和酚等以上试剂均购自宝生物工程有限公司。3. CHAT、β-actin引物序列: CHAT:正义链 5'GTCTTGGATGTTGTCATTAATTTC-3;反义链 5'TCTCTGGTAAAGCCTGTAGTAAGC-3';扩增片段长度708bp;内参照β-actin;正义链 5'-CTTCTACAATGAGCTGCGTG-3';反义链 5'-TCATGAGGTAGTCAGTCAGG-3';扩增片段长度 305bp;以上引物由大连宝生物工程有限公司合成。

1.4实验方法

1.4.1提取总RNA

采用异硫氰酸胍法。取冰冻组织(0.1-0.2g)剪碎后加入异硫氰酸胍变性液2ml(100mg/1ml),冰上匀浆后,分装,每管各500μl。每管依次加入50μl 2mmol/L的乙酸钠;500μl水饱和酚;氯仿/异戊醇(24∶1)100μl,冰浴操作,充分混匀,4℃孵育15min。12000rpm, 4℃离心20min,小心移上层水相至另一新的EP管中;加等量的异丙醇,-20℃沉淀1h;4℃,10000rpm离心10min。弃上清,悬RNA于75%乙醇150μl中,振荡,室温孵育10min;4℃,10000rpm离心5min;弃上清,总 RNA干燥至透明前。依据总RNA量多少加20-40μl不等的0.1%焦碳酸二已酯(DEPC)溶解RNA。用紫外分光光度仪测总RNA的产量,纯度及浓度(波长260nm/280nm)。

1.4.2 cDNA的合成

据总RNA的浓度取适量的总RNA,使逆转录的总RNA量为8μg,先65℃水浴10min,RT 反应液中依次加入5×Reaction buffer4μl;20U/μl Ribonuclease inhibitor1μl;2.5mMdNTPs2μl;100μg/mlOli(dT)18 1μl; 100U/μl AMV2μl;总RNA2-4μl;加0.1%DEPC水至总体积20μl。将上述混合液加入薄壁离心管中,置入PCR仪,反应条件为42℃,60min,后95℃,10min,得到cDNA。

1.4.3聚合酶链反应(PCR)

PCR反应体系为:D.W26μl;10×PCRbuffer5μl; 25mMMgCl 3μl; 2.5mMdNTPs 4μl; 引物正义链1μl; 引物反义链1μl; cDNA 10μl; 引物浓度为30pmol/μl a) 目的基因的扩增:上述反应液先94℃,5min,之后加入Taq plusDNA聚合酶0.5ul/每管,分别用TH和CHAT 的引物进行PCR,循环30个周期。b) 内标准β-肌动蛋白(β-actin)的扩增:上述反应液先94℃,5min,之后加入Taq plusDNA聚合酶0.5ul/每管,用β-actin的引物进行PCR,循环30个周期。ChAT的PCR反应条件为:94℃,30S,63℃,1min,72℃,2min。CHAT的PCR反应条件为94℃,30S;60℃,30S;72℃,1min

1.4.4 PCR产物定量

10μl PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳后,溴化乙锭(EB)染色,紫外灯下观察结果,拍照。通过图像分析将CHAT与β-actin辉度比值进行相对定量。统计学处理,方差齐性检验,两均数用t检验。

2.结果

琼脂糖凝胶电泳实时荧光定量PCR 法检测不同组TH的相对表达量见图1. 图2

说明:① 造模后大鼠ChAT因缺血荧光定量明显缺失,与正常对照组相比差异有显著性( P<0.01 )。

② 治疗组经电针治疗后7d ChAT荧光定量接近正常,与实验组相比差异有显著性( P<0.01 )。

图1


226

257

281 β-actin

403 (305bp)

521

659

908 ChAT

(bp) (708bp)


6h 24h 3d 7d

Maker 对照组 实 验 组

( 梗塞 )

图2

90

100

226

257

281 β-actin

403 (305bp)

521

908 CHAT

( bp) ( (708 bp)


6h 24h 3d 7d

Maker对照组 治 疗 组

(梗塞+针刺)

3.讨论

3.1学习记忆相关的系统和神经生物学物质 中枢胆碱能系统与学习记忆密切的关系[2]。中枢胆碱能系统的核团主要集中基底前脑,统称为基底大细胞核群,其核团包括:内侧核、斜角带水平部、斜角带垂直部、无名质及白球腹侧部等[3]。隔内侧核和斜角带垂直部其胆碱能纤维经过穹窿主要投射到海马结构。无名质及白球腹侧部(大细胞基底核)的胆碱能纤维广泛投射到大脑新皮层[4] 。实验证明隔核-海马的传导通路与空间识别、工作记忆有关,大细胞基底核-大脑物质的传导通路与学习过程的调制、参照记忆有关[5]。它们的损伤可导致皮质、海马以及大细胞基底核细胞萎缩及胆碱乙酰转移酶(choline acetyl transferase,CHAT) 和乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AchE)活性明显降低和学习、记忆功能的损害[6]。胆碱能功能体系包括乙酰胆碱(Acetylcholine,ACh)、ChAT和 AChE。生物学测定发现,脑内大部分区域这3者间有着较好的一致性[7]。但AChE 在中枢神经系统的分布比较广泛,不仅存在于胆碱能细胞,也存在于非胆碱能细胞中,而ChAT是 Ach的合成酶,它与Ach的分布几乎平行,故常作为研究胆碱能神经的标记酶或估计Ach含量的间接指标。ChAT是Ach的生物合成酶,是胆碱能系统活性的特异性标志。

3.2胆碱乙酰转移酶-乙酰胆碱 乙酰胆碱储存于胆碱纤维末梢的突触小泡内。乙酰胆碱的合成、转运、释放和灭活过程。有胆碱转运系统、胆碱乙酰转移酶,胆碱受体 和乙酰胆碱酯酶4类高度特异性蛋白参与。乙酰胆碱很大程度上有赖于突触小泡功能正常和胆碱乙酰转移酶的促进合成[8],换句话说,突触小泡膜蛋白和胆碱乙酰转移酶的生物活性和含量对乙酰胆碱促进学习记忆的生物学功能的正常发挥可能起关键性的作用。胆碱乙酰转移酶主要存在胆碱纤维能纤维的胞浆内,与乙酰辅酶A和胆碱结合,将乙酰辅酶乙酰基转移到胆碱上,合成的乙酰胆碱主要储存于突触小泡内。由于胆碱乙酰转移酶可合成乙酰胆碱,而乙酰胆碱具有促进学习记忆的生物功能,因此认为胆碱乙酰转移酶在脑内的含量高低与动物学习记忆能力强弱成正相关。其证据来源于对阿尔茨海默病和轻度认知障碍病理发生过程中的研究[9] [10] [11]。这些研究证明胆碱乙酰转移酶与认知功能存在直接因果关系。

3.3针刺对中枢胆碱能系统的影响 近年的针刺研究中发现,针刺对大脑神经递质的释放和传递有着广泛的影响,特别是对中枢胆碱能系统作用的影响不仅仅局限于针刺镇痛发面,通过对胆碱酯酶和乙酰胆碱活性和含量的影响,发挥着对中枢神经系统功能方面的调节作用[12]。逆转录-聚合酶链反应(reverse transcr -iption-polymerase chain reaction,RT-PCR)是分子生物技术实验室中的首选方法之一 ,具有简便、安全、快速、灵敏、特异性强等特点 ,近年来广泛应用于动物的微生物检测[13-14] 。我们应用荧光定量 RT- PCR技术,通过对大鼠脑梗死后CHAT的动态变化及针刺后的影响的研究,来探讨学习记忆障碍的神经生物学基础可能机制及针刺的影响,以便进一步研究脑功能及临床应用。本实验证实造模后大鼠CHAT因缺血荧光定量明显缺失,与正常对照组相比差异有显著( P<0.01 )。治疗组经电针治疗后7d CHAT荧光定量接近正常,与实验组相比差异有显著性( P<0.01 )。说明电针治疗可促进CHAT的表达,对大鼠的学习记忆障碍有改善作用,可能与针刺效应改变了大脑AchE、 ChAT活性及 Ach含量,进而增强了中枢胆碱能系统的功能活动有关,但学习记忆障碍还有其他因素的参与。因此针刺的作用机理有待于更深入的研究。

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