基于丙型肝炎病毒NS5基因序列分析的基因分型

中国抗感染化疗杂志2003年1O月3O日第3卷第5期基于丙型肝炎病毒NS5 B基因序列分析的基因分型张继明 尹有宽 谢 怡 卢 清 张清波 邬祥惠 翁心华[摘要] 目的:建立基于丙型肝炎病毒(HCV)NS5B基因序列分析的基因分型方法,对上海地区慢性丙型肝炎进行基因分型。方法:用

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中国抗感染化疗杂志2003年1O月3O日第3卷第5期

基于丙型肝炎病毒NS5 B基因序列分析的基因分型
张继明 尹有宽 谢 怡 卢 清 张清波 邬祥惠 翁心华
[摘要] 目的:建立基于丙型肝炎病毒(HCV)NS5B基因序列分析的基因分型方法,对上海地区慢性丙型肝炎进行基因分型。方法:用HCV RNA实时荧光定量检测试剂盒对慢性丙型肝炎患者血清标本的HCV RNA水平进行定量分析。用逆转录一聚合酶链反应(RT_PCR)和套式-PCR扩增HCV RNA阳性的41份标本的部分HCV NS5B区基因,PCR产物经回收、纯化后直接进行测序分析。从GenBank中下载25份不同基因型的HCV原型序列,用NS5B区222 bp的基因片段构建系统进化树,对临床标本相应的HCV NS5B区序列进行分析。结果:基于HCV NS5B基因序列的系统进化树分析,可成功地对本组41份标本进行基因分型分型结果显示,1b型占85.4 (35/41),2a型占12.20 (5/41),3a型占2.44 (1/41)。结论:基于HCV
NS5B区基因序列的系统进化树分析是一种可靠和方便的HCV基因分型方法。上海地区的HCV基因型以1b型为主。
[关键词] 丙型肝炎病毒; 基因型; 系统进化树分析
丙型肝炎病毒(HCV)感染已经成为慢性肝病最重要的病因之一,全球大约有1.5亿人受到HCV感染。a干扰素抗病毒治疗有助于减缓或终止肝纤维化、肝硬化的发生,降低肝癌的发生率。HCV基因型(Genotype)是影响a干扰素治疗效果的主要因素L1]。因此,丙型肝炎基因分型检测对疗效预测、预后的判断、决定疗程长短等均有重要意义。目前,HCV基因分型的方法有多种,而根据HCV NS5B区基因序列而进行的基因分型被公认为HCV基因分型的“金标准”[2]。本研究建立了基于HCVNS5B基因序列系统进化树分析(phylogenetic analysis)的基因分型方法,并对上海地区41例慢性丙型肝炎患者进行了基因分型,现将结果报道如下。
材料与方法

、病例
研究对象为2002年1—6月在复旦大学附属华山医院就诊的慢性肝炎病例,共41例,均为上海市居民,根据病史、抗一HCV 阳性、丙氨酸转氨酶(ALT)异常,临床上被诊断为慢性丙型肝炎。患者的年龄为21~69岁,其中38例有手术、输血史,1例有静脉注射毒品史,2例无明确的感染途径。
二、主要试剂
Trizol试剂为Bio—Basic Inc.公司产品;DEPC为Amresco产品;逆转录一聚合酶链反应(RT—PCR)试剂盒(Takara RNA PCR Kit vet.2.1)购自Taka—ra公司;HCV RNA荧光定量(FQ)PCR试剂盒购自深圳匹基公司。
三、抗一HCV和HCV RNA检测
抗一HCV 检测采用雅培(ABB0TT)试剂。HCV RNA检测采用FQ—PCR。操作步骤按试剂盒说明书进行。HCV RNA 阳性标本用于基因分型。
四、血清标本和HCV RNA抽提,所有患者于空腹采血,分离出的血清于一70℃保存备用。HCV RNA 抽提采用Trizol试剂(Bio-Basic Inc.),于100 tll血清中加入Trizol试剂300l,混匀后放置5 rain,加入氯仿80 l,混匀后放置15 rain,在4℃条件下,13 000 r/rain离心15 rain,吸上清液,加入等体积的异丙醇,13 000 r/rain离心10rain,弃上清液,用75 乙醇洗1次,用10 tll DEPC处理的水溶解,用于逆转录。
五、HCV RNA的逆转录和套式PCR检测引物设计参考文献[3—4],由上海申友生物技术公司合成。外引物序列如下:HCV一1:5'-TGGGGATCCCGTATGATACCCGCTGCTTTGA一3 (上游引物,位置在8245~8275,引物位置以GenBank登录号为M62321的HCV毒株为参照);H ,-2:5,_GGCGGAA TTCCTGGTCA TA GCCTCCGTGAA一3 (下游引物,8616~8645),扩增的片段长度为401bp。内引物 122S: 5,_CTCAACCGTCACT—GAGAGAGACAT一3 (上游引物,8276~ 8279);1 23A :5'-GCTCTCAGGTTCCGCTCGTCCTCC 3
(下游引物,8591~ 8614),扩增的片段长度为339bp。逆转录在20 l体系中完成,反应条件为42"C
60 rain,94℃ 5 min;第1轮PCR条件为:94*(2 2rain;94℃ 30 S,50℃ 35 S,68℃ 2.5 rain,35个循
环;最后68℃ 9.5 rain。取第1轮PCR产物1 tll作为模板,进行第2轮PCR,反应条件与第1轮相同。
六、HCV NSSB区基因序列测定及系统进化树分析
将第2轮PCR产物回收、纯化后直接用于测序,测序引物用123A。参照文献[-53的方法,用不同基因型的HCV NS5B基因中222 bp片段构建系统进化树,对临床标本相对应的NS5B序列进行系统进化树分析,得出HCV基因分型结果。1a型HCV全基因参照序列的Genbank登录号(AccessionNumber):D10749、M 62321、AF009606、M67463;1b型:AB049101、AF139594、AF176573、AJ132996、AJ238800;2a型:AB04640、AF169002、AF169005、AF23848 1、D00944;2b 型:AB030907、AF238486、D10988;2c型:D50409;3a型:AF046866、D28917、D17763;3b型:D49374;4a:Y11604;5a型:Y13184;6a型:Y12083。以上序列分析采用Vector NTISuite软件。
结 果
一 HCV RNA 的定量检测
41例患者血清的HCV RNA 均呈阳性,HCVRNA水平(把每毫升中病毒的拷贝数,换算成以10为底的对数值)在3.05~6.97之间,平均为5.73±1.11。
二、HCV参照序列NSSB基因的系统进化树的构建将已知基因型的HCV全基因的部分NS5B序列(222 bp)进行系统进化树分析,结果发现,这段222 bp序列可代表HCV全基因,用其构建的系统进化树能用于HCV的基因分型(见图1)。
三、HCV的基因分型
用以上构建的系统进化树可对41例慢性丙型肝炎患者进行基因分型(见图1)。结果显示,1b型占85.4 (35/41),2a型占12.2 9/5(5/41),3a型占2.4 (1/41),此例3a型患者有静脉吸毒史。未发现其他基因型,分型成功率达100 9/6。图1根~HCVNS5B序列构建的系统进化树及41例慢性丙型肝炎患者的Hcv基因型分型结果
讨 论
由于HCV 编码的RNA 依赖的RNA 聚合酶缺乏校正功能,在HCV 复制过程中易产生碱基的错配,因此,HCV的变异率较高,是一种高度异质性的正链RNA 病毒。当HCV 全基因序列差异在30% 以上时,可界定为一种基因型,同一基因型HCV的全基因序列差异在20 以上时,可界定为一种亚型。同一亚型HCV的全基因序列差异可在10% 以上[6]。目前HCV可分为6个主要的基因型和70种以上的亚型。临床上用于HCV 基因分型的方法有多种,最常用的是根据5 端非编码区(5 NCR)序列差异而进行的基因分型方法,如线形探针(INNO-LiPA)方法、5 NCR序列的直接测序、限制性片段长度多态性(RFLP)-PCR等,但基于5 NCR 的基因分型方法对不同亚型的分型准确率有较大的差异,对1b、1a、2a、2b、2c、3a亚型的分型准确率分别为76 、91% 、20% 、50 和96 ,几乎不能对4a、4b和4c亚型进行区分,总准确率仅有76 ,这与5 NCR序列过于保守有关[7]。因为同一基因型、不同亚型HCV5"NCR序列的差异度仅为1 0A~3.3 ,而NS5B基因序列的差异度为16.5 ~20.1 ,NS5B基因更适合用于HCV的基因分型[8]。本研究采用的基于NS5B基因的系统进化树分型方法,能对本组所有标本进行基因分型,可作为HCV 基因分型的参照标准。
HCV的基因型呈地区性分布,我国主要以1b型为主。对本组41例慢性丙型肝炎的基因分型结果显示,上海地区以1b亚型为主,占85.4 ,其次为2a亚型,占12.2 ,与以往的报告相似 。。。总之,基于NS5B基因的系统进化树分型方法,能准确地对HCV进行基因分型,可作为HCV基因分型的参照标准。
参考 文 献
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2 Pawlotsky JM.Molecular diagnosis of viral hepatitis[J].Gas—troenterology,2002,122:1554~1568
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5 Stuyver L,van Arnhem WV ,Wyseur A,et a1.Classification ofhepatitis C viruses based on phylogenetic analysis of the envelope1 and nonstructural 5B regions and identification of five ad—ditional subtypes[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1994,91:10134-10138
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8 Sandres—Saune K ,Deny P,Pasouier C,et a1. Determ ining hepatitis
C genotype by analyzing the sequence of the NS5b region
[J].J Virological Methods,2003,109:18%193
9 金根娣,陆志檬.上海等地区慢性丙型肝炎患者中HCV基因型的分布[刀.中华肝脏病杂志,1997,5:212—21310 蒋伟伦,顾士民,鹾芸文,等.上海地区丙型肝炎病毒基因分型研究[J].中华肝脏病杂志,1999,7:29—30

作者单位 上海复旦大学附属华山医院感染科 200040
(收稽日期:2003—01—10)

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