5氟尿嘧啶上调干细胞标记物CD133在结肠癌细胞中的表达

随着中国生活水平的提高,结直肠癌的发病率不断上升。在美国,结直肠癌所致的死亡位于癌症所致死亡的第二位[1]。 新药研发改善了转移性结直肠癌患者的总体生存,然而,对于大多数晚期患者而言,治疗依然是姑息性的[2]。最近的证据表明,结肠癌由一组异质性的细胞组成,这些细胞的致肿瘤形成的能

正文

随着中国生活水平的提高,结直肠癌的发病率不断上升。在美国,结直肠癌所致的死亡位于癌症所致死亡的第二位[1]。 新药研发改善了转移性结直肠癌患者的总体生存,然而,对于大多数晚期患者而言,治疗依然是姑息性的[2]。最近的证据表明,结肠癌由一组异质性的细胞组成,这些细胞的致肿瘤形成的能力不同。肿瘤起始细胞亦称肿瘤干细胞(Cancer Stem Cell,CSC)定义为能启动并形成肿瘤的细胞,而且这些细胞能通过其表面的标记物被识别,CD133就是其中的标记物[3]。 CD133(Prominin-1)是5跨膜蛋白家族的首个成员,含865个氨基酸,有胞外N端,胞内C端,两个大的胞外环含8个糖基化的位点。尽管CD133 已经用于分离各种肿瘤的干细胞(包括结肠癌),其功能还不得而知[4]。

5氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)是消化系统肿瘤的基础用药,尤其是结直肠癌,所有的化疗方案都含氟尿嘧啶类药物,即使在疾病发展较缓慢,或者存在严重的合并症而使用单药治疗的患者,也必定使用5-FU,而不是其他有效的细胞毒药物如奥沙利铂或者伊立替康。根据肿瘤干细胞的理论,常规的细胞毒药物只能杀灭快速增长的细胞,而CSC对细胞毒药物耐药, 从而导致肿瘤的复发及转移。那么,传统的化疗药物如5-FU到底对结肠癌干细胞有怎么样的影响?本文拟通过5-FU对结肠癌干细胞标记物CD133的作用探讨5-FU对结肠癌干细胞的影响,同时论证肿瘤干细胞的理论应用于在结肠癌细胞株中。

材料及方法

1 试剂

5-FU购于Sigma公司,将其溶于双蒸的水中制成100g/ml浓度的储存溶液,置于-20oC 的冰箱中备用,根据需要稀释成不同浓度的实验溶液。

2 细胞培养

6个结肠癌细胞株DLD1、HT29、HCT116、SW480、Lovo、RKO(由华盛顿大学干细胞中心Moon教授的实验室提供)培养于含100u/ml的青霉素和链霉素的10% DMEM中(Invitrogen),置于5% CO2的培养箱中在370c下培养,用于实验的细胞最多传代10次。

3 细胞活性测定及计数

新型四唑氮盐方法(MTS)通过线粒体功能测定细胞活性,试剂盒为CellTiter Aqueous Assay Kit (Promega)。细胞以3,000 cells/well/100µl的浓度种于96孔板的培养皿,限制性稀释的方法将5-FU加入各个孔中,形成倍增的浓度梯度。48h后,加入20µLMTS,370c孵育1-4h,然后在ELISA机器490nm下读数,以空白对照为参照,计算出细胞活性的百分比。所有试验设平行三组,独立重复三次。

4 流式细胞仪分析(Fluorescence Activated Cell Analysis, FACS)

单个细胞混悬液与anti-CD133/2 (293C3-PE, Miltenyi)10:1 或者异构体对照 (mouse IgG2b -PE)10:1混合40C下染色30分钟,PBS洗脱后加入7AAD(BD Biosciences)以排除死细胞对结果的影响,上流式细胞仪(FACS Canto II,BD Biosciences)检测CD133阳性细胞的比例,所有试验设平行三组,独立重复三次。

5 磁珠细胞分离(Magnetic Activated Cell Separation, MACS)

单个混悬的细胞与anti-CD133/1磁珠微粒40C下混合(AC133, mouse IgG1, cell isolation kit, Miltenyi)30分钟,洗脱后通过磁柱,阳性细胞被吸附,而阴性细胞直接流过柱子,然后将阳性的细胞洗出。磁性分离后,台盼兰染色评估细胞活性,分离后的细胞以流式细胞仪检测阳性细胞和阴性细胞的纯度。细胞与anti-CD133/2 (293C3-PE, Miltenyi) 或者异构体对照 (mouse IgG2b -PE)混合染色30分钟,洗脱后加入7AAD(BD Biosciences)以排除死细胞对结果的影响,上流式细胞仪(FACS Canto II,BD Biosciences)检测CD133阳性细胞的比例,所有试验设三组并独立重复三次。

6 细胞克隆形成实验

MACS方法将DLD1细胞分为DLD1CD133+和DLD1CD133-两群细胞后,限制性稀释的方法将细胞稀释成1个/孔的浓度种植于96孔板,各3板,每3d更换培养液,10d后在显微镜下计算克隆形成的数量。

7 实时定量PCR(qPCR)

Qiagen试剂盒提取总RNA,Invitrogen逆转录酶逆转录成cDNA。与Taqman探针混合后在ABI PRISM 7300HT的机器(Applied Biosystems)进行PCR反应,引物为Hs01009257_m1 prominin1, 或者内源性对照4333762T ACTB(Applied Biosystems)。反应条件为:95℃10min,然后50×15s 95℃,60℃ 1min。相对定量通过比较Ct。数据处理和统计使用软件ABI PRISM SDS version 2.1 (Applied Biosystems)。所有试验设三组并独立重复三次。

8 统计分析

t检验比较两组间的差别。当P值小于0.05被认为是有统计学差异,数据以平均值±标准差( ±S)的方式显示。

结果

1 CD133在各个细胞株中的表达情况

FACS的方法检测结肠癌细胞株DLD1、HT29、SW480、HCT116、Lovo、RKO中CD133的表达情况,如图1所示,其表达率分别为30.2%、82%、0.34%、91.8%、85.3%、0.28%。其中只有DLD1细胞中有两个明显分开的细胞群分别为DLD1CD133+和DLD1CD133-,HT29中几乎所有的细胞都表达CD133,因此,以下的实验选取DLD1和HT29为主要研究对象。

5-FU剂量依赖性抑制结肠癌细胞生长:为了最佳的选用体外使用5-FU浓度,我们以MTS方法测定梯度5-FU浓度对HT29、DLD1细胞增殖的影响。细胞活性的测定在48h后,如图2所示,5-FU对HT29和DLD1的抑制都成剂量依赖性,IC50约为10µg/ml。

2 CD133阳性的细胞克隆生长能力较CD133阴性的细胞强

DLD1细胞明显有CD133阳性和CD133阴性,阳性的细胞比例为30.87%±2.51%,如图2A所示。通过MACS方法分离后阳性细胞群中CD133阳性细胞比例为87.21%±5.33%, 而阴性细胞群中阴性细胞的比例为84.3%±4.65%(图3A),DLD1细胞分为DLD1CD133+和DLD1CD133-两群细胞后,限制性稀释的方法将未分离和分离后的三群细胞以1个/孔的浓度种植于96孔板,各3板,10天后在显微镜下计算克隆形成的数量,结果显示DLD1、DLDCD133+和DLDCD133-细胞形成的克隆数分别为:39.67%±5.62%、46.33%±4.44%、31%±2%,DLDCD133+和DLDCD133-细胞之间的克隆形成能力比较有统计学差异,P=0.04,如图3B所示。两群细胞形成的克隆如图3C、3D所示。

3 CD133阳性的细胞对5-FU敏感性下降

MACS方法分离DLD1细胞后,DLD1、DLDCD133+和DLDCD133-细胞被不同浓度的5-FU处理,浓度梯度为0 µg/ml、6.25 µg/ml、12.5 µg/ml、25 µg/ml、50 µg/ml、100 µg/ml,48h后MTS方法测定三群细胞的活性,结果显示三条曲线基本平行,未分离的DLD1细胞位于中间,DLD1CD133+细胞的曲线在其他两条曲线的上方,与DLD1CD133-细胞相比,对5-FU的敏感性显著下降20%,P 和脑恶性胶质瘤中[7]。尽管其蛋白功能还不太明确,由于是一个肿瘤干细胞的标记物,用于分离肿瘤干细胞能有助于寻找靶向治疗肿瘤干细胞的靶点。

Bao等从恶性胶质瘤细胞中分离了CD133阳性的肿瘤干细胞,发现这些细胞对离子型的放疗不敏感,可能是由于DNA修复功能强[9]。Woodward等也发现乳腺癌的干细胞对放疗不敏感[10],Todaro等发现CD133阳性的细胞对5-FU和奥沙利铂的敏感性下降[11]。本研究将结肠癌细胞株DLD1中的两群细胞通过MACS的方法分离,发现CD133阳性的细胞在克隆形成能力方面较CD133阴性的细胞强,说明CD133阳性的细胞体外自我更新的能力比阴性的细胞强;通过MTS方法发现阳性细胞对5-FU的敏感性下降,也与干细胞对传统化疗药物耐药的假设;并且5-FU导致干性标记物CD133mRNA水平的表达上调,与肿瘤干细胞的假设相符,即传统的细胞药物杀灭快速分裂的细胞(CD133阴性细胞),而无法杀灭肿瘤干细胞,那么在细胞毒药物处理细胞后,肿瘤干细胞(CD133阳性)所占的比例将上调,表现为其标记物表达的上调,说明5-FU能富集CD133高表达的结肠癌干细胞,能为将来靶向治疗干细胞提供一种富集的方法。

本研究通过探讨从肠癌细胞中分离CD133阳性的细胞群,并证实阳性细胞自我更新能力强,对传统化疗药物不敏感,证明了肿瘤干细胞的理论在结肠癌细胞株中应用。5-FU能富集结肠癌肿瘤干细胞群。针对肿瘤干细胞的治疗将给治疗晚期癌症的患者带来新的希望。

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