氟尿嘧啶上调CD133阳性结肠癌干性细胞Wnt信号通路活性

结直肠癌是一种常见的肿瘤,其发病率在所有恶性肿瘤中排第三。尽管在西方国家结直肠癌的发病率已经开始下降,但在中国其发病率仍然呈上升趋势;尽管有关结直肠癌的治疗取得很大进展,但仍有50%的患者在治疗后出现复发,这些研究结果都表明改进结直肠癌的治疗仍有其必要性[1]。细胞耐药性是一直是

正文

结直肠癌是一种常见的肿瘤,其发病率在所有恶性肿瘤中排第三。尽管在西方国家结直肠癌的发病率已经开始下降,但在中国其发病率仍然呈上升趋势;尽管有关结直肠癌的治疗取得很大进展,但仍有50%的患者在治疗后出现复发,这些研究结果都表明改进结直肠癌的治疗仍有其必要性[1]。

细胞耐药性是一直是提高化学治疗疗效的瓶颈。越来越多的证据表明上皮来源的肿瘤包括结直肠癌是由小部分有自我更新能力的细胞称为肿瘤干性细胞(CSC)或者肿瘤起源细胞始动的,CSC有自我更新、分化成肿瘤内各种细胞的能力,及驱动恶性细胞增殖、浸润、转移的能力,CSC对化疗不敏感是导致肿瘤的复发的原因之一[2]。目前,识别肿瘤干性细胞的方法是使用特异性的标记物,如结肠癌干性细胞的标记物有CD133、CD44、CD166、ESA等[3,4]。

Wnt信号通路调节细胞的自我更新和多个器官的形成,其调节失控可导致肿瘤形成。经典的Wnt通路由β-catenin介导,Wnt配体通过Lrp5/6与axin的直接作用抑制β-catenin降解复合物的激酶活性,导致β-catenin在胞浆内蓄积并转移到核内,与转录因子LEF/TCF家族相互作用,调节Wnt靶基因的转录以及促进细胞增殖[5]。超过80%的散发性结肠癌有稳定ß-catenin的突变,并且有持续的经典Wnt信号通路激活,Wnt信号通路的异常激活在结直肠癌的发生发展过程中起着重要作用[6]。Zhu等[7]发现内源性Wnt信号激活能破坏隐窝的结构并导致CD133分子在隐窝细胞表达增加,形成高级别上皮内瘤变以及隐窝腺瘤。这一结果提示CD133阳性结肠癌干性细胞与Wnt信号通路之间的潜在联系。

我们已发现,氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)上调干性细胞标记物CD133在结肠癌DLD1细胞中的表达,5-FU可用于体外富集CD133高表达细胞,CD133高表达细胞的干细胞功能强,包括克隆形成能力、致肿瘤形成能力等[8,9]。CD133阳性的干性细胞对5-FU耐药,那么5-FU对CD133阳性结肠癌干性细胞的Wnt信号通路是否有影响、Wnt信号通路活性与干性细胞产生耐药性有关,干预Wnt信号通路能否对干细胞耐药有逆转作用非常值得探讨.

1 材料及方法

1.1 试剂及其来源

5-FU购于Sigma公司,将其溶于双蒸水中制成100g/ml浓度的储存溶液,置于-20oC 的冰箱中备用,使用时根据需要稀释成不同浓度的实验溶液。Wnt信号抑制剂DKK-1购于PeproTech公司,磷酸缓冲液(PBS)购于Invitrogen公司。青霉素、链霉素和胎牛血清购于GIBCO公司, 培养基DMEM购于Invitrogen公司。CD133的抗体、磁珠微粒及异构体对照购于Miltenyi公司,放线菌素D(7-AAD)(BD Biosciences),台盼蓝购于(Sigma Aldrich)。磁珠分离机MiniMACSTM购于Miltenyi公司

流式细胞仪使用的型号为FACS Canto II,BD Biosciences,

1.2 细胞培养

结肠癌细胞株DLD1(含Wnt信号通路报告系统的DLD1细胞株,由华盛顿大学干细胞中心Moon教授的实验室赠送)培养于含100u/ml青霉素、100µg/ml链霉素和10% 胎牛血清(GIBCO)的DMEM,置于5% CO2的培养箱中在370c下培养。用于实验的细胞最多传代10次。

1.3 流式细胞仪分析(Fluorescence Activated Cell Analysis, FACS)

单个细胞混悬液与anti-CD133/2 (293C3-PE)10:1 或者异构体对照 (mouse IgG2b -PE)10:1混合40C下染色30分钟,PBS洗脱后加入7-AAD以排除死细胞对结果的影响,上流式细胞仪检测CD133阳性细胞的比例,所有试验设平行三组,独立重复三次。

1.4 磁珠细胞分离(Magnetic Activated Cell Separation, MACS)

单个混悬的细胞与anti-CD133/1磁珠微粒40C下混合(AC133, mouse IgG1, cell isolation kit)30分钟,洗脱后通过磁柱,阳性细胞被吸附,而阴性细胞直接流过柱子,然后将阳性的细胞洗出。磁性分离后,台盼兰染色评估细胞活性,分离后的细胞以流式细胞仪检测阳性细胞和阴性细胞的纯度。细胞与anti-CD133/2 (293C3-PE) 或者异构体对照 (mouse IgG2b -PE)混合染色30分钟,洗脱后加入7-AAD以排除死细胞对结果的影响,上流式细胞仪检测CD133阳性细胞的比例。所有试验设三组并独立重复三次。

1.5 细胞生长曲线

5.8×105个DLD1、DLD1CD133+和DLD1CD133-细胞分别接种于含1μg/ml 5-FU培养液的6个培养盘中,分别于24小时和48小时后收集细胞,台盼蓝色,以细胞计数器计算每个培养盘中的细胞计数,并计算出均数和标准差,制成生长曲线图。

1.6 Wnt通路活性荧光酶检测:

含TCF报告系统的细胞在96孔板中培养,向每个孔内加入至少能够覆盖全部细胞的1×PLB(BD Bioscience)。室温下温柔振荡20 分钟,使细胞充分裂解。将细胞裂解液从板上刮下并储存于Ep 管中。将Luciferase 和溶剂在用前等体积混合均匀,加入含有细胞裂解液的96孔板孔中。先后在荧光测量仪上测量Firefly、Renilla荧光酶的活性,以Firefly/Renilla的比值百分数来表示Wnt信号通路的活性。

1.7 DKK-1抑制实验:

50ng/ml浓度的DKK-1抑制CD133+细胞的Wnt信号通路,48小时后,收集细胞,流式细胞仪检测CD133的表达。48小时后,洗去DKK-1,在培养基中加入5-FU 1ug/ml,对照空白组细胞也加入5-FU 1ug/ml,48小时后7-AAD染色凋亡的细胞,流式细胞仪检测凋亡细胞的比例。

1.8 统计分析

应用SPSS13.0统计软件分析实验数据,观察5-FU处理后细胞Wnt通路活性的改变情况,数据均采用平均值±标准差( ±SD)表示,t检验比较两组间的差别,当P值小于0.05被认为是有统计学差异。

2 结果

2.1 CD133在DLD1细胞株中的表达情况和MACS分离

FACS的方法检测CD133在结肠癌细胞株DLD1中的表达率为31.2±2.51%,因此以CD133为标记物能显著区分两群细胞。通过MACS方法分离DLD1中的CD133阳性和CD133阴性细胞,分离后的阳性细胞和阴性细胞以CD133+细胞、CD133-细胞表示。再以FACS方法检测两群细胞的纯度,CD133+细胞纯度为87.2±5.33%,CD133-细胞纯度为84.3±4.65%,如图1所示。

2.2 细胞在含5-FU培养基中生长的比较

5.8×105个DLD1、CD133+和CD133-细胞在含5-FU 1μg/ml的培养液中的生长曲线如图2所示。CD133+细胞的生长曲线在DLD1细胞(P=0.031)和CD133-细胞(P=0.011)的上方,CD133+细胞在5-FU的培养基中生长速度明显较DLD1细胞和CD133-细胞快,而这三群细胞在普通培养基中的生长速度并无明显差别,说明CD133+细胞对5-FU的敏感性低于CD133-细胞,P=0.012。

2.3细胞Wnt信号通路活性的差异

含TCF报告系统的荧光酶检测结果显示,未分离的DLD1细胞的Wnt信号通路活性为41.2±1.4%,CD133+细胞和CD133-细胞的Wnt通路活性分别为46.29±0.30%,33.87±2.65%,CD133+细胞的Wnt信号通路活性高于CD133-细胞,P=0.009, 说明CD133+细胞有更强的自我更新能力。

2.4 5-FU对DLD1CD133+、DLD1CD133-细胞的Wnt信号通路活性的影响

0μg/ml(对照组)、1μg/ml及10μg/ml浓度的5-FU处理CD133+、CD133-细胞,检测处理后的细胞Wnt信号活性强度并计算出平均值和标准差。结果如图3所示,小剂量的5-FU(1μg/ml)和大剂量5-FU(10μg/ml)均使DLD1CD133+细胞Wnt信号通路的活性上调,分别从46.29±0.3%上升到90.06±10.01%(P=0.012)、52.92±2.46%(P=0.047)。CD133-细胞的Wnt通路活性为33.87±2.65%, 5-FU 1μg/ml、 10μg/ml处理后,Wnt信号通路活性分别为35.51±3.28%和26.45±0.38%,P值分别为0.434、0.046。

2.5 以DKK-1抑制CD133阳性细胞中的Wnt通路活性对细胞的影响

50ng/ml浓度的DKK-1(PeproTech Inc)抑制CD133+细胞的Wnt信号通路,48小时后,CD133的表达从87.21±5.33%降至60.62±3.12%,P=0.022,图4A。DKK-1处理后的CD133+细胞的凋亡较比对照组明显增加,28.3±0.6%比11.8±0.2%,P=0.013,如图4B所示。

3 讨论[Gan5]

肿瘤细胞原发性或者继发性耐药是癌症化学治疗的最大瓶颈。治疗过程中无法清除对治疗不敏感的肿瘤干性细胞是肿瘤复发转移的根本原因。已有不少研究发现CSC或者表达干细胞标记物的细胞对常规的肿瘤治疗耐药。Bao等[10]发现手术切除的脑胶质瘤细胞分离出的CD133+CSC由于DNA修复的活性而耐受离子型放射治疗。Todaro等[9]发现CD133+细胞和无血清培养的小球状细胞对结直肠癌常规化疗药奥沙利铂和5氟尿嘧啶的敏感性较CD133-的细胞低,抗IL-4受体的抗体治疗降低CD133+细胞的活性,并提高化疗的疗效,抗IL-4抗体通过降低生存分子而导致小球状细胞凋亡,体内抑制IL-4或者中和IL-4的抗体均能缩小异位皮下种植的肿瘤,从而确认了肿瘤干性细胞的模型及CSC对肿瘤治疗的耐受性,并提供了耐药性发生的机制。Woodward等[11]发现表达干性细胞标记物的乳腺癌干性细胞对放疗耐受,并发现异位表达Wnt及β-catenin可扩大耐放射的细胞群,提示Wnt信号与CSC的自我更新能力和耐受治疗的特性相关。有研究通过比较阿霉素敏感和不敏感细胞株之间的基因差别,结果显示除了MDR1基因表达在耐药株中增高外,表达最高是Wnt通路的必需因子--Wnt鬃毛受体-1(FZD1) ,FZD1的上调介导Wnt通路的持续激活和靶基因的激活,ShRNA介导FZD1沉默导致MDR1表达的下调,且使细胞重新获得对药物的敏感性[12]。还有研究报道,肝癌细胞对5-FU的耐药性与Wnt通路相关,Wnt靶基因只在对药物不敏感的肝癌细胞中表达,Wnt基因的激活诱导肝癌细胞对5-FU的耐药性[13]。

然而,化疗药物对肿瘤干性细胞中的Wnt信号通路的影响,以及Wnt信号通路活性对CSC耐药性的影响还未见报道。我们之前已经建立以CD133阳性细胞为结肠癌干性细胞的研究系统,并发现常规的化疗药物5-FU能增加干性标记物CD133在结肠癌细胞中的表达,且增加细胞的干性[8]。本研究以CD133为标记物分离DLD1细胞株中的干性细胞,比较CD133阳性干性细胞和CD133阴性分化细胞之间Wnt信号通路活性的差别,发现CD133阳性干性细胞的Wnt信号通路的活性强于CD133阴性细胞,与干性细胞自我更新能力强相一致;5-FU使CD133阳性细胞Wnt信号通路变得更强,说明5-FU不仅不能抑制CD133+细胞的Wnt信号通路活性,反而增强了CD133+细胞的Wnt信号通路活性,增加CD133+细胞的自我更新能力,可能与形成正反射相关,使化疗药物更加难以进入干性细胞内,且5Fu对CD133阳性干性细胞的反复刺激可能诱发Wnt信号通路系统活性反射性增加,从而进一步巩固对药物的抗性,并逐渐发展对多种药物的耐受性,小剂量5-FU对CD133阴性细胞的Wnt通路活性没有影响,大剂量5-FU抑制Wnt信号通路活性,抑制CD133阴性细胞阴性细胞增殖,对Wnt信号通路活性低下的CD133阴性细胞,5-FU可进入细胞后通过干扰DNA合成致Wnt通路活性的降低;CD133阳性细胞在含5-FU的培养基中增殖速度明显比CD133阴性细胞快,CD133阳性细胞对化疗药物5-FU敏感性低;以Wnt信号通路抑制因子DKK-1处理CD133阳性结肠癌干性细胞后,细胞对5-FU的敏感性增加,说明抑制Wnt信号通路能部分逆转CD133+细胞对药物的耐受性。因此,研究Wnt信号通路在结肠癌肿瘤干细胞耐药产生中起的作用有广阔的应用前景,可能通过该领域的研究开发出抗肿瘤干细胞的药物。

综上所述,Wnt信号通路参与了CD133+结肠癌干性细胞耐药性的调节,常规化疗药5-FU使CD133阳性结肠癌干性细胞的Wnt信号通路活性进一步增强,与肿瘤干细胞对化疗不敏感相关,抑制Wnt信号通路的活性可能增加结肠CSC对化疗药物的敏感性。进一步的研究还应该探讨Wnt信号通路调节细胞药物敏感性的位点、研究全面干预Wnt信号通路的活性对药物敏感性的影响、体内研究联合抗Wnt信号通路的药物和化疗药物对肿瘤的抑制作用。

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